圣谷同创叶颖：ctDNA之路漫漫，吾将上下而求索
摘要
7月19日晚，火石百家邀请了北京圣谷同创科技发展有限公司副总裁叶颖博士，为大家分享“ ctDNA的临床应用之路 ”。叶博士在演讲中介绍了ctDNA的前世今生、生物学特性、检测平台现状、产品设计要素等，并着重分享了圣谷同创在ctDNA领域的辛苦耕耘和精彩的临床案例。
叶颖，医学博士，圣谷同创副总裁，毕业于美国约翰霍普金斯大学医学院分子病理学专业。20年生物技术和医学研究经验，侧重肿瘤超早期诊断，白血病机制研究，造血干细胞移植，分子病理及高通量测序技术在临床检验中的应用。4年临床医师、10年研究平台和独立医学实验室管理运营经历。具有成功领导科研项目实施和临床转化的经验，在国际期刊上发表过多篇论文。
分享环节
ctDNA因其广泛的临床应用前景，已成为目前学术界和投资界追逐的热门话题。但它到底能不能克服临床应用的考验，通过国家相关部门的监管，在临床得到广泛的应用呢？希望今天的分享能带给大家一些启示。
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循环肿瘤DNA的前世今生
1948年发现人体外周血中存在游离DNA 1977年发现化疗后癌症病人体内游离DNA迅速下降1994年胰腺癌病人体内发现带有KRAS突变的游离DNA 1997年怀孕妇女血浆中发现胎儿游离DNA Lo，开启了无创产前诊断领域的革命21世纪迅速成为研究的热点，重量级文章频发，进入临床应用探讨模式。
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循环肿瘤DNA的生物学特性
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ctDNA的检测平台现状
从最初的定量PCR技术，到现在的数字PCR和二代测序技术，对ctDNA的检测逐步实现了高敏感度和高通量。以下是几种ctDNA测序平台的对比：
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ctＤＮＡ临床应用
肿瘤突变组合就像万花筒，原发灶与转移灶、治疗前与治疗后、同一原发灶的不同克隆，突变的组合都不尽相同。
血浆中的ctDNA承载了这些不同，因此ctDNA在临床上可应用于：明确肿瘤分子分型、监测疗效、耐药发现、微小残留监测、预后评估、复发监测等。随着ctDNA监测技术敏感性和特异性的提升，甚至可用于辅助肿瘤早期诊断和高危人群筛查。
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ctDNA临床应用产品设计要素
目前已有许多研究证实ctDNA的临床应用是可行的。除此之外，一项实验室技术真正成为临床检测技术还需要考虑哪些问题呢？
如何选择检测平台？
ctDNA的检测平台主要分2种，PCR或NGS。它们的技术特点各有优劣。
选择哪一种平台，需要综合考虑以下因素：检测目的、样本的量、时间的要求、检测已知少量位点还是多基因多位点、如何通过法律法规监管、选择什么的建库方式、应用于医院还是独立医学实验室。
如何选择检测Panel?
需要综合考虑以下因素：具体的临床应用目的、如何通过法律法规监管、富集的方法。
检测后分析如何？
▪ 生物信息数据库：越丰富越好；▪ 医学信息数据库：越新越好；▪ 积累样本：越多越好；
▪ 数据处理：分析能力越强越好。
判断分析的好坏,主要从以上几个方面考虑。
另外，血液标本的采集、储存及检测过程的标准化和自动化也是设计ctDNA临床应用产品需要考虑的重要因素。总之，一个好的临床检测产品需要满足快速、精准、低成本、易操作和流程标准化的要求。
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圣谷检验的ctDNA之路及案例分析
1、平台选择
2014年，我们开始研发ctDNA产品，选择了半导体高通量平台。这个平台够快、够准、对样本需求量小、通量合适，适于医院使用。通过不断的积累，目前有近3万例的多癌种组织样本基因变异数据，其中800例肿瘤患者有配对的不同时间采集的血浆样本。数百例正常人的血浆、白细胞突变组数据可以作为对照，有效排除SNP的影响。
2、panel的设计和优化
Panel的设计比较灵活，既有专门针对单个癌种的，也有针对多个癌种的。在ctDNA检测的过程中，我们对关键质控环节进行了优化。
▪ 游离DNA提取优化：操作更便捷，浓度和纯度更高；
▪ DNA起始检测量降低至1ng，测序准确度达到99.99%，最低检测突变丰度可达到0.5%；
▪ 突变过滤算法优化：降低背景噪音； ▪ 整个检测流程标准化。
3、临床验证研究
完成了实验室方法学的验证之后，我们开始与多家医院合作，进行临床验证研究。
▶ 举例：晚期肺癌ctDNA突变检测临床验证
用二代测序方法对147位III-IV期非小细胞肺癌病人的外周血血浆ctDNA及肿瘤组织DNA分别进行50个肿瘤相关基因体细胞突变检测，将获得的结果与肿瘤组织结果对比：一致性为88%; 敏感性为92%;特异性为85%（圣谷与天津总医院及北大人民医院胸外科合作研究数据）。
4、案例分享
测序深度：圣谷的平均测序深度是10000X。如此高的测序深度观测到的突变有临床意义吗？
积累的数据显示：当ctDNA与组织样品突变阳性一致，突变丰度<1%时，与组织的阳性一致率达91%，对应组织样品的平均突变丰度为23.8%。
Off-label 用药：女病人，63岁，卵巢癌术后11月余，发现左锁骨上包块1月，疑复发入院，开始使用传统化疗方案——吉西他滨+顺铂，1月后不见好转。ctDNA发现EGFR p.L858R突变，使用TKI抑制剂凯美纳，病情缓解，CT提示转移灶缩小。
肺癌动态监测：女病人，46岁，干咳1月余，CT发现肺占位1周，诊断：肺癌并多发转移。术前ctDNA提示EGFR L858R突变，随后开展动态监测，监测周期1月/次。手术很成功，术后ctDNA明显下降，应用传统化疗方案——培美曲赛+顺铂，ctDNA从药物使用后第二个月开始上升，持续到4.5个月，临床评估疾病进展。更换为吉非替尼，ctDNA迅速下降，影像学确认瘤体缩小。
上图中，红线代表ctDNA丰度变化，绿色代表肿瘤大小变化。可以看出，EGFR L858R的ctDNA突变丰度与影像学检查一致，而且灵敏度更高，可提前监控癌症进展。
结直肠癌动态监测：16位III-IV期结直肠癌患者，接受FOLFOX一线化疗方案，在化疗前及一个疗程结束后抽取外周血进行ctDNA检测，并对比两次检测之间的突变丰度。根据影像学结果把患者分为SD,PR,PD三组。
可以看出，ctDNA突变丰度变化与临床评估一致。
总结
ctDNA临床应用渐行渐近，但离进入临床实践还有距离。目前，ctDNA的临床应用还需要大规模实验的验证。我们希望ctDNA能打开肿瘤个体化治疗的宝库，让上百万的肿瘤病人最终受益。
问答环节
提问1：请问圣谷的ctDNA检测的性能参数指标，尤其是早期肿瘤的检测结果比其他文章发表的数据都要稍微好一些，原因是什么？
叶博士：刚才提到产品设计的多个要素。其中，我们从DNA 的提取到建库方法的建立，到分析算法的验证都申请了专利。在这些因素综合下，我们的敏感度和特异性都比较高。
提问2：请问ctDNA目前国内市场竞争格局怎样？有多少企业在做，有没有营业收入？其技术壁垒在哪里？同时工艺的难易程度如何？
叶博士：目前有几十家企业，但是规模都是很大，营业收入没有披露，但ctDNA处于临床验证阶段，所以收入估计不多。技术壁垒方面，各家公司都有专利，但重叠部分不多。除了技术本身，后续分析也很重要。测序本身的工艺难度并不是很大，从样本采集，到建库方式选择，到扩增方式选择，再到分析算法，这一整个流程下来，多个环节都会影响准确度。这是一个集成性的技术，影响因素多。
提问3：由于ctDNA属于新兴项目，很多临床医生觉得这个检测的意义不是特别大，从哪个点可以说服医生接受这个项目呢？
叶博士：可以从传统活检的检测难点入手：肿瘤的异质性、肿瘤病人术后取不到组织样本、转移灶不易取得，此时用血浆ctDNA检测可以获得很多有用信息。液体活检是组织活检的有效补充。
提问4：您好，刚才在讲课过程中有提到贵公司使用ctDNA的量可以是1ng，约等于300个基因组，请问贵公司的平均有效测序深度是多少？对于少量的ctDNA，例如1ng，请问如何做到0.5%？有多少有效突变reads支持时认为是可靠的突变？
叶博士：我们的ctDNA检测一般使用2ml的血浆，可以产生20-200ng的ctDNA。通过建库方法优化可以将量将到1ng，但不代表每个检测都要维持这个量。1ng ctDNA中约只含300个基因组拷贝，测序过程中的PCR扩增可将300个基因组拷贝扩大至10000以上，另外，我们优化的实验方法可选择性抑制gDNA扩增，高效的保证ctDNA有效扩增。我们要求平均测序深度大于10000X，可靠的突变不单只看有效reads数，还要考虑其它质量指标，如总覆盖度、区域均一性、链偏向性等。
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